Célula de programación

Nov 12, 2023

Nature Chemical Biology volumen 18, páginas 385–393 (2022) Citar este artículo

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Los biosensores sin células son plataformas poderosas para monitorear la salud humana y ambiental. Aquí, ampliamos sus capacidades al conectarlos con circuitos de desplazamiento de hebras mediados por toehold, una nanotecnología de ADN dinámica que permite el cálculo molecular a través de interacciones programables entre hebras de ácido nucleico. Desarrollamos reglas de diseño para interconectar una plataforma de detección de moléculas pequeñas llamada ROSALIND con desplazamiento de cadena mediado por toehold para construir circuitos híbridos de ARN-ADN que permiten el ajuste fino de la cinética de reacción. Usamos estas reglas de diseño para construir 12 circuitos diferentes que implementan una gama de funciones lógicas (NOT, OR, AND, IMPLY, NOR, NIMPLY, NAND). Finalmente, demostramos un circuito que actúa como un convertidor de analógico a digital para crear una serie de salidas binarias que codifican el rango de concentración de la molécula que se detecta. Creemos que este trabajo establece un camino para crear diagnósticos "inteligentes" que utilizan cálculos moleculares para mejorar la velocidad y la utilidad de los biosensores.

La biodetección sin células está emergiendo como una plataforma de tecnología de diagnóstico de bajo costo, fácil de usar y desplegable en el campo que puede detectar una variedad de compuestos químicos relacionados con la salud humana y ambiental1,2. En esencia, estos sistemas constan de dos capas: una capa de biodetección basada en proteínas o ARN y una capa de salida de construcción informadora. Mediante el cableado genético de estas capas, se genera una señal cuando el compuesto objetivo se une al biosensor y activa la expresión del indicador (Fig. 1). Las reacciones se ensamblan incorporando estas capas dentro de sistemas sin células y liofilizándolas para un fácil almacenamiento, transporte y rehidratación con una muestra de interés en el punto de necesidad1,3. Con este enfoque, los biosensores sin células han detectado con éxito compuestos relacionados con la salud humana, como zinc4 y moléculas de detección de quórum de bacterias patógenas5, fármacos como gamma-hidroxibutirato6 y contaminantes del agua como fluoruro1, atrazina2, antibióticos y metales pesados7.

(Superior) Un biosensor sin células generalmente se activa cuando un compuesto objetivo (entrada) se une a un factor de transcripción de proteína (capa sensora) que está configurado para activar la expresión de una construcción informadora (capa de salida). Esto da como resultado la producción de una señal detectable como la fluorescencia. (Inferior) La adición de una capa de procesamiento de información aguas abajo antes de la generación de la señal puede mejorar el rendimiento y ampliar la función de los biosensores sin células al agregar características computacionales como el procesamiento lógico y la comparación de señales. Aquí, esto se implementa conectando la capa de salida de biodetección para producir un ARN monocatenario capaz de activar circuitos de desplazamiento de hebra mediados por toehold que generan señal.

Sin embargo, los biosensores libres de células existentes a menudo carecen de una capa de procesamiento de información que pueda manipular las respuestas de la capa de detección antes de la generación de la señal (Fig. 1). Estas capas de procesamiento de información son una característica natural de los organismos y permiten que las células activen respuestas de estrés, guíen el desarrollo y tomen decisiones de comportamiento sobre la base de señales intracelulares y extracelulares8. Por esta razón, las capas de procesamiento de información genética que implementan la lógica y la retroalimentación se han aprovechado y diseñado ampliamente en sistemas celulares sintéticos9,10. De manera similar, hemos demostrado anteriormente que los circuitos basados ​​en ARN se pueden agregar a una plataforma de biosensores sin células llamada Sensores de salida de ARN activados por ligand INDuction (ROSALIND) para mejorar su especificidad y sensibilidad sin modificar los biosensores de proteínas7. Sin embargo, estos circuitos aún actúan directamente en la capa de detección o de salida, lo que limita nuestra capacidad para mejorar y expandir su función.

Aquí, desarrollamos una capa de procesamiento de información generalizable para mejorar y expandir la función de ROSALIND aprovechando el desplazamiento de la cadena de ADN mediado por el punto de apoyo (TMSD), una nanotecnología de ADN computacionalmente poderosa que puede procesar información molecular in vitro11. En TMSD, las entradas de ADN monocatenario (ssDNA) intercambian cadenas con 'puertas' de ADN de doble cadena a través de interacciones de emparejamiento de bases complementarias para producir cadenas de salida de ssDNA. Al configurar las puertas de ADN en diferentes arquitecturas de red, se puede realizar una variedad de operaciones, como la restauración de señales12, la amplificación de señales13 y el cálculo lógico14,15, muy similar a una arquitectura computacional química general16. La termodinámica bien caracterizada del emparejamiento de bases de ADN permite construir grandes redes a partir de bloques de construcción simples. Además, la cinética de la reacción se puede ajustar con precisión cambiando la fuerza de los 'puntos de apoyo': regiones monocatenarias dentro de las puertas de ADN que inician el proceso de desplazamiento de la cadena17. El TMSD ha llevado al desarrollo de potentes dispositivos que incluyen osciladores in vitro18, amplificadores catalíticos19, motores moleculares autónomos20,21 y nanoestructuras de ADN reprogramables22,23. Por lo tanto, existe un gran potencial para el procesamiento de información basado en TMSD para mejorar los biosensores libres de células.

Aunque los circuitos TMSD se han utilizado para detectar objetivos de ácidos nucleicos como microARN24,25 y patógenos humanos26, actualmente no existen reglas generales de diseño para activar circuitos TMSD con moléculas pequeñas para permitir su uso en biosensores sin células. Por lo tanto, buscamos crear una interfaz que pueda convertir el evento de unión de un objetivo químico en cambios en las hebras de ácido nucleico que pueden desencadenar cascadas de TMSD. Los factores de transcripción alostéricos (aTF) crean naturalmente esta interfaz al activar la transcripción de una secuencia de ARN programable al detectar un objetivo químico. Sin embargo, existen desafíos sustanciales al combinar aTF y circuitos TMSD para que funcionen juntos in situ, como la interferencia entre la ARN polimerasa (RNAP) y las puertas de ácido nucleico27, la falta de caracterización experimental de los circuitos TMSD mediados por ARN28 y las complejidades del plegamiento del ARN que obstaculizan Función de circuito TMSD.

Aquí, abordamos estos desafíos mediante el desarrollo de reglas de diseño para interconectar las capas de detección de ROSALIND7 con los circuitos TMSD. Primero mostramos que el diseño de una nueva puerta de señal de ADN se puede optimizar para permitir la transcripción in vitro (IVT) impulsada por T7 RNAP y TMSD dentro de la misma reacción. A continuación, desarrollamos las reglas de diseño de la estructura secundaria del ARN para ajustar la cinética de reacción de TMSD, mejorando notablemente la velocidad de respuesta. También aplicamos este principio para interconectar TMSD con varios aTF diferentes para crear biosensores para sus ligandos afines. Luego mostramos la capacidad de programación de la plataforma mediante la construcción de 12 circuitos diferentes que implementan siete funciones lógicas diferentes (NOT, OR, AND, NOR, IMPLY, NIMPLY, NAND). Finalmente, utilizando un enfoque basado en modelos, construimos un circuito TMSD multicapa que actúa como un convertidor de analógico a digital (ADC) para crear una serie de salidas binarias que codifican el rango de concentración de la molécula objetivo. En conjunto, este trabajo demuestra que TMSD se puede utilizar para implementar cálculos moleculares para ampliar las capacidades de los biosensores sin células.

Para interconectar ROSALIND con TMSD, primero buscamos validar que un ARN monocatenario puede desplazar una hebra de una puerta de señal de ADN. Modificamos una puerta de señal de ADN de un trabajo anterior para crear una puerta con un punto de apoyo de ocho nucleótidos en su extremo 3′, con una hebra etiquetada con un fluoróforo y la otra hebra con un extintor (Datos complementarios 1)29. Luego, diseñamos una hebra de ARN invasor (InvadeR) para que sea completamente complementaria a la hebra de fluoróforo, de modo que la hebra desplace la hebra extintora para generar una salida fluorescente. Cuando combinamos InvadeR purificado con la puerta de señal de ADN, observamos la activación de la fluorescencia sobre un control sin InvadeR (Figuras complementarias 1 y 2a). De esta manera, InvadeR se comportó de manera similar a una hebra de ssDNA invasora (InvadeD), aunque la titulación de InvadeR resultó en una meseta de fluorescencia a concentraciones más bajas que InvadeD (Fig. 2a,b complementaria). En particular, NUPACK30 predice que InvadeD tiene una estructura menos estable que InvadeR, y que InvadeR puede unirse a sí mismo para formar un dúplex, lo que podría inhibir la función de InvadeR (Figura complementaria 2c-e, Datos complementarios 2 y 3).

A continuación, determinamos si InvadeR se puede transcribir in situ en presencia de la puerta de señal de ADN para generar una señal. Siguiendo el diseño de la plataforma ROSALIND, elegimos una polimerasa de fago procesiva rápida, T7 RNAP, y configuramos la plantilla de ADN para que constara de la secuencia mínima del promotor T7 de 17 pares de bases (pb) seguida de dos guaninas de inicio y la secuencia InvadeR (Datos complementarios 1). Inicialmente observamos que T7 RNAP podría generar una señal fluorescente solo a partir de la puerta de señal de ADN (Datos extendidos Fig. 1b). Sobre la base de informes anteriores27,31,32,33, planteamos la hipótesis de que T7 RNAP estaba iniciando la transcripción desde la región de apoyo 3 'de la puerta de señal de ADN, lo que provocó el desplazamiento de la cadena y la generación de señal (Datos extendidos Fig. 1a). Para probar esta hipótesis, invertimos la polaridad de la puerta de señal de ADN para incluir un extremo de punto de apoyo de 5 'y no observamos señal de fluorescencia de la puerta de señal de ADN de punto de apoyo de 5' (Datos extendidos Fig. 1b). El análisis de electroforesis en gel de urea-poliacrilamida (urea-PAGE) de las especies de ARN de cada reacción IVT también mostró productos secundarios de ARN solo de la reacción con la puerta de señal de ADN de 3 'toehold (Datos extendidos Fig. 1c). Confirmamos que la 2′-O-metilación de la puerta de señal de ADN33 elimina de manera similar la transcripción espuria (Datos extendidos Fig. 1d-f).

Con el diseño optimizado de la puerta de señal de ADN, luego usamos TMSD para rastrear las salidas de ARN generadas por IVT in situ impulsada por T7 RNAP. Nos enfocamos en optimizar el diseño de InvadeR para la generación rápida de señales. Sobre la base de los resultados en la Fig. 2 complementaria, planteamos la hipótesis de que la estructura secundaria de InvadeR desempeñaría un papel fundamental en la eficiencia del TMSD, por ejemplo, al interferir con la unión del punto de apoyo y la invasión de la hebra34,35. Para probar esta hipótesis, diseñamos cinco variantes diferentes de InvadeR, cada una con diferentes estabilidades previstas y estructuras secundarias en el extremo 3′ (Fig. 2a). Cuando se agregó una cantidad equimolar de cada variante de InvadeR purificada en gel a la puerta de señal de ADN, observamos que las magnitudes de las señales de fluorescencia se ordenaron de acuerdo con las energías libres mínimas previstas de cada variante (Fig. 2b). Además, cada versión reforzada mostró una fluorescencia sustancialmente menor que la correspondiente variante no reforzada.

a, Se diseñaron tres variantes diferentes de InvadeR. La variante 1 incluye las dos guaninas de iniciación seguidas de la secuencia completamente complementaria a la cadena de fluoróforo. Para las variantes 2 y 3, se insertaron dos o tres nucleótidos adicionales entre las guaninas de inicio y la secuencia de InvadeR (regiones sombreadas), de modo que rompieran la estructura secundaria en su base. Se crearon versiones reforzadas de las variantes 2 y 3 para estabilizar la estructura, manteniendo constantes el número y las posiciones de los nucleótidos insertados. Todas las variantes tienen el mismo número de nucleótidos que interactúan con la puerta de señal del ADN. Las energías libres mínimas y las probabilidades de emparejamiento de bases para cada estructura se predicen usando NUPACK a 37 °C30. nts, ​​nucleótidos. b, se agregaron variantes de InvadeR purificadas en gel (5 µM) a una cantidad equimolar de la puerta de señal de ADN y se cuantificó la activación de la fluorescencia. La variante 3 genera la señal fluorescente más alta, seguida de las variantes 2 y 1, mientras que ambos mutantes fortalecedores muestran una disminución en la señal de sus respectivas variantes por la reducción de veces indicada arriba de las barras. c, cuando se incluye una plantilla de ADN que codifica InvadeR con T7 RNAP y la puerta de señal de ADN, la salida de ARN se puede rastrear in situ monitoreando la activación de la fluorescencia desde la puerta de señal. d, Comparación de la cinética de fluorescencia de las tres variantes de IVT utilizando una plantilla de ADN equimolar (50 nM) o un control negativo sin plantilla. e,f, la comparación de la cinética de fluorescencia entre las variantes y sus mutantes fortalecedores para la variante 2 (e) y la variante 3 (f), muestra que el fortalecimiento de los pares de bases tiene un impacto negativo en la cinética de fluorescencia. Todos los datos que se muestran son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como un punto (b) o una línea (d–f) con fluorescencia sin procesar estandarizada para MEF (fluoresceína µM). Cada altura de barra en b representa el promedio de estas réplicas. Las barras de error (b) y el sombreado (d–f) indican el promedio de las réplicas ± sd

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Luego probamos la cinética de reacción TMSD de las variantes transcritas in situ. Cuando se agregaron 50 nM de la plantilla de ADN que codifica cada variante de InvadeR a la mezcla de reacción de IVT (Fig. 2c), observamos la activación de fluorescencia más rápida de la variante 3 seguida de las variantes 2 y 1 (Fig. 2d), de acuerdo con lo anterior. experimento. También observamos respuestas más lentas de las versiones reforzadas, reafirmando nuestra hipótesis (Fig. 2e,f).

Sin embargo, observamos discrepancias entre las estabilidades de la estructura secundaria predichas cuantitativamente y la cinética de reacción. Específicamente, las variantes reforzadas con valores mínimos de energía libre más bajos muestran una cinética de reacción más rápida y valores de fluorescencia de punto final más altos que la variante 1 (Fig. 2d-f), lo que contradice los resultados observados en la Fig. 2b. Descubrimos que variar la eficiencia de transcripción T7 RNAP de cada plantilla de ADN36 contribuye a esta discrepancia, aunque la estructura secundaria del ARN tiene un mayor impacto en la velocidad de respuesta del TMSD (Datos extendidos Fig. 2). También descubrimos que agregar una secuencia terminadora T7 al final de la plantilla de ADN acelera la reacción, aunque no considerablemente (Fig. 3 complementaria y Datos complementarios 3).

Juntos, estos resultados muestran que la incorporación de consideraciones de estructura secundaria y eficiencia de transcripción en los principios de diseño de InvadeR se puede aprovechar para mejorar la velocidad de reacción.

A continuación, determinamos si la transcripción de InvadeR se puede regular con un aTF para crear un biosensor sin células que utilice salidas TMSD. Esto requirió que insertáramos una secuencia de operador de aTF entre el promotor T7 y la secuencia InvadeR para permitir la regulación de la transcripción de aTF. Anteriormente demostramos que el espacio entre la secuencia del promotor T7 y la secuencia del operador aTF es importante para la regulación eficiente de IVT en las reacciones ROSALIND7,37. De manera similar, encontramos que un espaciador de 2 pb genera una señal TMSD robusta sin TetR, que se redujo a niveles casi de referencia cuando se regulaba por TetR (Fig. 3a, b).

a, las IVT pueden regularse alostéricamente con una plantilla configurada para unirse a un aTF purificado (TetR) a través de una secuencia operadora (tetO) colocada aguas abajo del promotor T7. Se construyó una serie de espaciadores a intervalos de 2 pb para evaluar el impacto de la longitud del espaciador en la capacidad de TetR para regular la transcripción de InvadeR. b, Datos de punto final (a 1 h) mostrados para variantes de espaciador promotor-operador reguladas (con dímero TetR 5 μM, plantilla de ADN 50 nM) y no reguladas (sin TetR). c, la inducción de una reacción IVT regulada por TetR ocurre en presencia del ligando afín, aTc, que se une a TetR y evita su unión a tetO. Esto permite que continúe la transcripción, lo que conduce a la activación de la fluorescencia a través de TMSD. d, respuesta a la dosis con aTc, medida a 1 h con plantilla de ADN 50 nM y dímero TetR 5 μM. La concentración de ligando más baja en la que la señal se distingue del fondo se determinó utilizando una prueba t de Student heteroscedástica de dos caras contra la condición sin ligando, y el rango del valor de P se indica con asteriscos (***P < 0,001, **P = 0,001–0,01, *P = 0,01–0,05, el valor P exacto para 5 µM aTc = 5,064 × 10−5). Los valores de P exactos junto con los grados de libertad para todas las concentraciones de ligando analizadas se pueden encontrar en los datos de origen. Los datos para la condición sin ligando se excluyeron porque el eje x está en la escala logarítmica y se presentan en los datos de origen. e, la velocidad de salida del TMSD es más rápida que la salida del aptámero de ARN. f, Comparación de la cinética de fluorescencia entre el InvadeR regulado por TetR y las salidas de aptámero cuando se inducen con 10 μM de aTc. Todos los datos que se muestran son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como un punto (b, d) o una línea (f) con valores de fluorescencia sin procesar estandarizados para MEF (fluoresceína μM). Las barras de error (d) y el sombreado (f) indican el promedio de las réplicas ± sd

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Usando el espaciador de 2 pb, luego determinamos si TetR se puede desreprimir con su ligando afín, anhidrotetraciclina (aTc) para permitir la transcripción de InvadeR (Fig. 3c). Cuando se agregó un rango de concentraciones de aTc a las reacciones IVT, cada una de las cuales contenía una plantilla de ADN 50 nM, un dímero TetR 5 µM y una puerta de señal de ADN 5 µM, observamos una fuerte represión hasta cantidades micromolares bajas de aTc, con la mitad de la inducción máxima entre 2,5 y 5 µM de aTc (Fig. 3d).

Debido a la rápida velocidad de las reacciones de TMSD17, planteamos la hipótesis de que la velocidad de inducción mediada por ligando de la salida de InvadeR sería mucho más rápida que la salida del aptámero de ARN de ROSALIND utilizada anteriormente que está sujeta a la unión cromófora lenta y al mal plegamiento34,38,39 (Fig. 3e). Como era de esperar, observamos que la plataforma InvadeR activa la fluorescencia visible en ~ 10 min, que es aproximadamente cinco veces más rápido que la plataforma de aptámero de ARN (Fig. 3f).

En general, estos resultados demuestran que un biosensor basado en aTF se puede interconectar con éxito con las salidas de TMSD, lo que lleva a mejoras inmediatas en la velocidad de reacción.

A continuación, determinamos si el sistema es compatible con diferentes familias de aTF para detectar varias clases de moléculas pequeñas. Además de TetR, elegimos TtgR40 y SmtB41 como aTF representativos de la familia MarR42 y la familia SmtB/ArsR43, respectivamente. Colocamos la secuencia de operador afín de cada aTF 2-bp aguas abajo del promotor T7 e inmediatamente aguas arriba de las secuencias de InvadeR (Datos extendidos Fig. 3a-c). Cuando se usó tetraciclina para inducir reacciones reguladas por TetR, observamos una señal fluorescente fuerte y robusta visible en ~ 10 min (Datos extendidos Fig. 3d, g). De manera similar, cuando se agregó naringenina, un ligando afín de TtgR, a las reacciones reguladas por TtgR, nuevamente vimos una activación de fluorescencia robusta solo en presencia de naringenina (Datos extendidos Fig. 3e, h). Sin embargo, la introducción de la secuencia smtO resultó en velocidades de reacción mucho más lentas incluso en reacciones no reguladas (Datos extendidos Fig. 4c). Curiosamente, se predice que la secuencia smtO formará una fuerte horquilla con la secuencia InvadeR (datos extendidos, Fig. 4a), que, según nuestros resultados en la Fig. 2, podría afectar las velocidades de reacción. Para mejorar la cinética de la reacción, diseñamos un módulo de aislamiento estructural de ARN para evitar el plegamiento de smtO:InvadeR intramolecular (Datos ampliados Fig. 4), que mostró una activación de señal más rápida de una reacción regulada por SmtB en presencia de ZnSO4 con una señal de fondo baja ( Datos extendidos Fig. 3f,i).

Juntos, estos resultados demuestran que las estrategias de diseño de ARN se pueden utilizar para extender modularmente la plataforma ROSALIND con circuitos TMSD.

La interfaz de biosensores sin células con TMSD brinda oportunidades para diseñar dispositivos modulares que pueden realizar tareas programadas en respuesta a entradas de moléculas pequeñas. Esto es especialmente cierto porque los circuitos TMSD tienen reglas de diseño más simples que los circuitos de proteínas44, existen modelos computacionales que predicen con precisión su comportamiento34,35 y hay un conjunto emergente de herramientas de diseño de circuitos TMSD45,46. Por lo tanto, aprovechamos estas características para crear una capa de procesamiento de información TMSD para ROSALIND.

Primero diseñamos y construimos puertas lógicas para procesar dos ligandos diferentes como entradas al sistema. Específicamente, adaptamos diseños anteriores de puertas lógicas TMSD, AND y OR, que detectan entradas de ácido nucleico12,14,15,46 (Fig. 4). Implementamos la lógica OR mediante el diseño de puertas OR de ADN que actúan como una capa intermedia entre InvadeR y la puerta de señal. Una vez que un ligando químico desencadena la transcripción de InvadeR, InvadeR realiza TMSD en su puerta OR de ADN correspondiente para liberar una hebra de salida de ssDNA, que posteriormente puede invadir la puerta de señal de ADN para producir una señal (Fig. 4a y Datos complementarios 4)46 . Las dos puertas OR de ADN comparten el mismo dominio de salida (verde), pero InvadeR las activa reguladas por dos ATF diferentes. La inclusión de estas puertas OR junto con las plantillas de ADN, los aTF y la puerta de señal condujeron a una generación rápida de señales, excepto cuando no había ligandos objetivo (Fig. 4b y Datos complementarios 5). El modelado de la puerta OR utilizando un conjunto de ecuaciones diferenciales ordinarias (ODE) que describen las reacciones IVT y TMSD (consulte la Información complementaria para obtener detalles sobre el modelo ODE utilizado) coincidió con las tendencias experimentales (Datos extendidos Fig. 5a y Datos complementarios 6).

a, Una puerta OR de dos entradas incluye dos puertas OR de ADN adicionales. Cuando cualquiera de los ligandos activa la transcripción, las hebras de InvadeR pueden reaccionar con sus respectivas puertas OR de ADN para producir una hebra de salida con un dominio (verde) que puede invadir la puerta de señal de ADN. b, cuando la puerta OR de dos entradas se activa con tetraciclina, ZnSO4 o ambos, se observa activación de fluorescencia. c, Una puerta AND de dos entradas contiene una puerta AND de ADN que requiere que ambas hebras de InvadeR se disocien de la hebra de salida para revelar el punto de apoyo complementario a la puerta de señal. Las características de diseño, como los controladores termodinámicos (resaltados en rojo) y un dominio de sujeción, se implementan para facilitar un TMSD eficiente con una fuga mínima (datos extendidos, Fig. 6). d, la puerta AND de dos entradas activa la fluorescencia solo cuando están presentes tetraciclina y ZnSO4. e, una puerta NOT incluye dos plantillas de ADN: una plantilla InvadeR no regulada y una plantilla inversora regulada por aTF. Tras la transcripción, el inversor regulado por aTF forma una estructura de horquilla que se asemeja a la puerta de señal de ADN para crear una puerta NO de ARN. InvadeR no regulado reacciona preferentemente con la puerta NOT de ARN debido a un mayor número de interacciones de pares de bases y un desajuste de pares de bases con la puerta de señal de ADN (rojo). Se incluye una secuencia espaciadora para evitar que la secuencia tetO interfiera con la puerta RNA NOT. f, cuando se implementa con un sensor de tetraciclina, la puerta NOT genera una señal en ausencia de tetraciclina. Todos los datos que se muestran son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como una línea con el valor de fluorescencia sin procesar estandarizado para MEF (fluoresceína μM). El sombreado indica el promedio de las réplicas ± sd Los dominios con el mismo color comparten la misma secuencia excepto por la puerta AND donde el dominio resaltado en naranja se modifica del dominio naranja en la puerta OR para mejorar su eficiencia TMSD. Todas las puertas de ácido nucleico se dibujan de acuerdo con las estructuras secundarias predichas usando NUPACK a 37 °C30. La secuencia de cada dominio y las concentraciones de componentes en cada puerta se pueden encontrar en los Datos complementarios 4 y 5, respectivamente.

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A continuación, diseñamos una puerta AND TMSD basada en ARN adaptando un diseño de puerta AND anterior47 que consta de tres dominios: dominio 1 complementario a InvadeR 1 (azul), dominio 2 complementario a InvadeR 2 (naranja) y dominio 3 complementario al ADN puerta de señal (verde) (Fig. 4c y Datos complementarios 5). Las hebras de InvadeR se diseñaron para tener diferentes secuencias de toehold para minimizar la unión no deseada de toehold al dominio de puerta AND incorrecto. La implementación de esta arquitectura en las reacciones de detección que utilizan TetR y SmtB inicialmente no condujo a ninguna activación de fluorescencia en ninguna condición (Datos extendidos, Fig. 6b). Para impulsar las reacciones de TMSD, incorporamos desajustes en la puerta AND que actúan como controladores termodinámicos de TMSD48 (Datos extendidos Fig. 6a). Aunque los controladores termodinámicos mostraron activación de señal por InvadeR, se observó una fuga sustancial con la condición de InvadeR 1 solamente (Datos extendidos Fig. 6c). Para reducir esta fuga, implementamos una característica de diseño adicional llamada abrazadera en el dominio 3 de la puerta AND que evita el TMSD parcial solo en presencia de InvadeR 149. Al aumentar la longitud de la abrazadera a 7 pb, construimos una puerta AND que requiere hebras InvadeR inducibles de tetraciclina y ZnSO4 para la generación de señales (Fig. 4d, Datos extendidos Figs. 5b y 6e y Datos complementarios 5).

La construcción de puertas lógicas más complejas más allá de AND y OR requiere un circuito NOT, que bloquea la señal en presencia de un ligando objetivo. Para lograr la inversión de la señal, diseñamos una puerta NO de ARN que es capaz de secuestrar InvadeR lejos de la puerta de señal de ADN (Fig. 4e y Datos complementarios 4) 47,50. Para sesgar la unión de InvadeR a la puerta NO de ARN, incluimos tres características de diseño: (1) un punto de apoyo más largo en la puerta NO de ARN que en la puerta de señal de ADN; (2) emparejamiento de bases adicional en el bucle de la puerta NOT de ARN; y (3) una falta de coincidencia (resaltada en rojo) entre InvadeR y la puerta de señal de ADN (Datos extendidos Fig. 6f-j). También diseñamos una secuencia espaciadora entre la puerta NOT de ARN y el operador tetO para aislar estructuralmente la secuencia tetO de la secuencia de puerta NOT (Fig. 4e). Cuando se implementaron estas características de diseño, observamos una reducción de la señal en presencia de tetraciclina (Fig. 4f, Datos extendidos Fig. 5c y Datos complementarios 5). No se observó inversión de señal de una plantilla de control cuya secuencia se mezcla desde la puerta NOT de ARN inducible por tetraciclina (datos extendidos, Fig. 7a, b). Se aplicó la misma arquitectura de diseño para construir una puerta NOT de ARN inducible por ZnSO4 (datos extendidos, figuras 5d, 6k-m y 7c, d, y datos complementarios 4 y 5).

Estos resultados establecen un conjunto de reglas de diseño para construir circuitos TMSD en cascada para el cálculo de puertas lógicas más complejas.

A continuación, superpusimos los componentes lógicos básicos para realizar cálculos lógicos complejos, incluidos NOR, NAND, IMPLY y NIMPLY.

Comenzamos con NOR, una inversión de la puerta OR que genera señal solo cuando todas las entradas están ausentes, mediante la combinación de dos puertas NOT de ARN, cada una regulada por TetR o SmtB (Fig. 5a y Datos complementarios 4). Con ambas puertas NO de ARN diseñadas para secuestrar el mismo InvadeR expresado constitutivamente, observamos la activación de la fluorescencia solo en ausencia de ambas entradas de ligando (Fig. 5b, Datos extendidos, Fig. 5e y Datos complementarios 5).

a, Una compuerta NOR de dos entradas se construye superponiendo dos compuertas RNA NOT. Las puertas NOT están reguladas por TetR o SmtB que secuestran las moléculas InvadeR no reguladas de la puerta de señal de ADN. b, la activación de la fluorescencia se observa solo en ausencia de ambas entradas. c, Una puerta IMPLY de dos entradas combina una puerta OR de ADN con una puerta NOT de ARN. En este ejemplo específico (ZnSO4 IMPLY tetraciclina), la puerta OR está regulada por TetR y la puerta NOT está regulada por SmtB, lo que evita la generación de señales solo en presencia de ZnSO4. d, se observa activación de fluorescencia a menos que solo se agregue ZnSO4. Se observa una generación de señal más rápida a partir de la condición de entrada de solo tetraciclina debido a que no hay desajuste entre la hebra de salida de la puerta OR y la puerta de señal. e, una puerta NAND de dos entradas pone en capas dos puertas OR de ADN no reguladas con dos puertas NOT de ARN reguladas. En esta configuración se requiere la presencia de ambas entradas para dificultar la generación de señal. Los controladores termodinámicos (resaltados en rojo) se incorporan en las puertas NOT para favorecer las interacciones con sus respectivas hebras de InvadeR. f, se observa el cálculo esperado de la puerta NAND. g, Se construye una puerta NIMPLY de dos entradas combinando la puerta AND de ADN y la puerta NOT de ARN. En este ejemplo específico, se requieren InvadeR inducido por tetraciclina e InvadeR no regulado para la activación de la puerta AND. Una puerta NOT regulada por SmtB secuestra el InvadeR no regulado. h, la activación de la fluorescencia se observa solo en presencia de tetraciclina. Todos los datos que se muestran son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como una línea con el valor de fluorescencia sin procesar estandarizado para MEF (fluoresceína μM). El sombreado indica el promedio de las réplicas ± sd Los dominios con el mismo color comparten la misma secuencia excepto por la puerta AND donde el dominio resaltado en naranja se modifica del dominio naranja en la puerta OR. Todas las puertas de ácido nucleico se dibujan de acuerdo con las estructuras secundarias predichas usando NUPACK a 37 °C30. La secuencia de cada dominio y las concentraciones de componentes en cada puerta se pueden encontrar en los Datos complementarios 4 y 5, respectivamente.

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A continuación, nos enfocamos en la arquitectura A IMPLY B, que bloquea la señal solo cuando A está presente y B está ausente. La puerta de tetraciclina ZnSO4 IMPLY se construyó colocando en capas la puerta OR de ADN inducida por tetraciclina con la puerta NOT de ARN inducida por ZnSO4 (Fig. 5c y Datos complementarios 4). Cuando se implementó, la puerta generó una señal en todas las condiciones de entrada, excepto cuando solo estaba presente ZnSO4 (Fig. 5d y datos extendidos, Fig. 5f). Sin embargo, observamos que la falta de coincidencia integrada entre InvadeR y la puerta de señal (resaltada en rojo) resultó en una señal fluorescente más lenta y más baja de la condición sin entrada o ambas entradas que de la condición de solo tetraciclina, y se observaron efectos similares. de la puerta de tetraciclina IMPLY ZnSO4 (Datos extendidos Figs. 5g y 7e,f). Curiosamente, las puertas IMPLY también se pueden construir sin la puerta OR de ADN, lo que permite interacciones directas entre la hebra InvadeR inducida por ligando y la puerta de señal (Figuras de datos extendidos 5h, i y 7g-j). La capacidad de diseñar arquitecturas de puertas alternativas para el mismo cálculo lógico destaca la modularidad de la plataforma.

Luego construimos una puerta NAND, que combina las puertas NOT y AND para producir señales en todas las condiciones excepto cuando ambas entradas están presentes. Exploramos dos opciones de diseño: (1) inversión de un hilo de salida de puerta AND (A NAND B = NOT (A AND B)); y (2) dos puertas NOT de ARN integradas en la arquitectura de puerta OR (NOT (A AND B) = NOT A OR NOT B). Debido a las restricciones de secuencia impuestas por la primera opción de diseño, elegimos construir la puerta NAND usando la segunda opción (Fig. 5e). Este diseño involucra cuatro plantillas de ADN diferentes: dos plantillas no reguladas, cada una de las cuales codifica InvadeR para su puerta OR de ADN correspondiente y dos plantillas reguladas, cada una de las cuales codifica la puerta NOT de ARN capaz de secuestrar su respectivo InvadeR. Para evitar la cinética de reacción TMSD más lenta observada en el diseño de la puerta IMPLY, en su lugar, introdujimos un controlador termodinámico en la puerta RNA NOT (resaltada en rojo) para favorecer el TMSD de InvadeR con la puerta RNA NOT sobre la puerta DNA OR (Fig. 5e). Cuando se implementó, tanto la tetraciclina como el ZnSO4 fueron necesarios para evitar la generación de señales (Fig. 5f y Datos extendidos. Fig. 5j).

Finalmente, diseñamos la puerta A NIMPLY B, que combina las puertas AND y NOT para producir una salida solo cuando la entrada A está presente sola. El diseño de puerta NIMPLY específico que se muestra en la Fig. 5g utiliza la puerta NOT de ARN inducida por ZnSO4 junto con una puerta AND de ADN que requiere InvadeR no regulado e InvadeR inducido por tetraciclina para la activación. Tanto la compuerta de tetraciclina ZnSO4 NIMPLY como la compuerta de tetraciclina NIMPLY ZnSO4 realizaron los cálculos esperados de la compuerta lógica (Fig. 5h y Figs. de datos extendidos 5k, l y 7k).

Juntos, estos resultados muestran que los componentes básicos de la puerta lógica se pueden superponer para realizar cálculos moleculares más complejos utilizando moléculas pequeñas como entradas al sistema.

Para demostrar una aplicación práctica del procesamiento de información TMSD, luego nos enfocamos en cuantificar los resultados del biosensor. En los sistemas típicos de biodetección sin células, las salidas se generan cuando la concentración del compuesto de entrada está por encima de un umbral de detección, creando una interpretación de resultados de "presencia/ausencia" ajustada a este umbral51. Este umbral de detección está determinado por las constantes de unión aTF-ligando y aTF-ADN, que pueden ser difíciles de ajustar. Para abordar esta limitación, diseñamos un sistema como un circuito ADC52 para crear una serie de salidas binarias que codifican la concentración de entrada analógica del compuesto objetivo (Figura 4 complementaria).

Para construir un circuito ADC genético, primero creamos un circuito comparador, un bloque de construcción de ADC que produce una salida binaria 'Verdadera' cuando la entrada está por encima de un umbral predefinido. El umbral es posible en TMSD porque la cinética de reacción se puede aumentar con precisión al alargar las regiones de punto de apoyo de la puerta de ADN17 (Fig. 6a). Usando esta función, construimos una puerta de umbral de ADN sin etiquetar que comparte la misma secuencia con la puerta de señal de ADN pero con un punto de apoyo más largo de ocho nucleótidos (Fig. 6a). Debido a que la señal debe activarse solo después de que la puerta de umbral se haya consumido por completo, razonamos que al ajustar la cantidad de la puerta de umbral, podemos controlar con precisión el momento en que InvadeR activa la fluorescencia de la puerta de señal. El modelado de este comportamiento cinético mostró que este es de hecho el comportamiento predicho de la configuración, y observamos experimentalmente un acuerdo cuantitativo con las predicciones del modelo (Fig. 6b). De esta forma, una reacción TMSD con umbral actúa como un circuito comparador 'cinético': para una entrada dada, el tiempo en el que se produce la generación de la señal es proporcional a la cantidad de puerta de umbral.

a, se puede usar el aumento de la longitud de la región del punto de apoyo de la puerta de ADN para acelerar el proceso de invasión de la hebra. Una puerta de ADN no etiquetada con un punto de apoyo más largo (ocho nucleótidos) puede entonces reaccionar preferentemente con InvadeR, actuando como un umbral programable. InvadeR solo puede desplazar la cadena de la puerta de señal (toehold de cuatro nucleótidos) después de que se agote la puerta de umbral. b, Titular la puerta umbral de ocho nucleótidos en diferentes proporciones por encima de una concentración de puerta de señal fija (0–8x) da como resultado un retraso en la activación de la fluorescencia que se puede modelar cuantitativamente con simulaciones ODE (líneas punteadas). Todos los datos mostrados para n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como una línea. Los valores de fluorescencia sin procesar se estandarizaron primero a MEF (fluoresceína μM) y se normalizaron al MEF máximo entre todas las condiciones para acomodar su comparación con las simulaciones (consulte Métodos para conocer el método de normalización utilizado). El sombreado indica el promedio de las réplicas ± sd c. Se crea un circuito ADC molecular construyendo una tira de pruebas del mismo sensor, y cada prueba contiene una concentración diferente de la puerta de umbral de ADN. Una concentración de puerta de umbral más alta requiere una concentración de ligando más alta para activar la fluorescencia. Cuando se aplica la misma muestra a cada tubo, un usuario puede obtener información semicuantitativa sobre la concentración de ligando presente en la muestra (entrada analógica) al identificar la serie de tubos que se activan (salida digital binaria). Aquí, definimos un tubo con su valor MEF> 0.5 como 'ENCENDIDO' porque el umbral visible está alrededor del valor indicado. d,e, Caracterización de un circuito ADC molecular para zinc usando simulaciones ODE (d) y datos experimentales de punto final a los 100 min (e) generados usando el sensor de zinc regulado por SmtB. Los valores en el mapa de calor representan el MEF promedio (fluoresceína μM) de n = 3 réplicas biológicas independientes (ver Datos extendidos Fig. 8 para todos los datos).

Datos fuente

A continuación, creamos una serie de circuitos comparadores TMSD de biodetección para actuar como un ADC para la concentración de ligando mediante la preparación de una serie de reacciones en las que cada tubo contiene una cantidad diferente de la puerta de umbral. Al agregar la misma concentración de ligando a cada tubo, un usuario puede observar qué tubos de la serie se activan en un momento específico y obtener información semicuantitativa sobre la concentración de ligando (Fig. 6c). Probamos la viabilidad del enfoque utilizando el mismo conjunto de ODE utilizado en la Fig. 6b con la adición de cinética de unión de aTF-DNA y aTF-ligando, centrándonos en la detección de zinc debido a su relevancia en los suministros de agua municipales53. Usando simulaciones de modelado, determinamos las concentraciones de puerta de umbral necesarias para activar uno, dos, tres o cuatro tubos después de 100 minutos correspondientes a concentraciones de zinc de 2, 3.5, 5 y 10 µM, respectivamente (Fig. 6d). Luego construimos el circuito ADC genético correspondiente con las reacciones TMSD reguladas por SmtB y vimos el patrón esperado de señales después de 100 minutos, donde la cantidad de tubos activados en la serie aumentó con concentraciones de ZnSO4 de entrada más altas (Fig. 6e y Datos extendidos Fig. 8a–d). Esta implementación permite que un usuario determine el rango de concentración de entrada de zinc leyendo directamente la secuencia de tubos activados.

Creemos que esta demostración representa el potencial de los circuitos TMSD para actuar como una capa de procesamiento de información de biosensores sin células que aumentan la facilidad de interpretación y el contenido de información de las señales de salida.

En este estudio, mostramos que los circuitos TMSD se pueden interconectar con IVT para actuar como una capa de procesamiento de información para biosensores sin células. La velocidad de las salidas de TMSD condujo a una mejora sustancial de la velocidad de generación de la señal, con menos de 10 minutos de tiempo de detección (Fig. 3f). Más importante aún, descubrimos que la naturaleza simple y definida de ROSALIND, combinada con el poder computacional de TMSD, nos permitió superponer varias puertas de ARN-ADN para construir 12 circuitos diferentes que implementan siete funciones lógicas diferentes de manera modular (Figs. 4 y 5). Aprovechando esta alta capacidad de programación de la plataforma, también diseñamos y validamos un circuito que puede estimar el rango de concentración de un compuesto objetivo desconocido dentro de una muestra (Fig. 6). Finalmente, esta plataforma es susceptible de liofilización (Datos extendidos, Fig. 9) y puede funcionar con matrices de muestras del mundo real sin procesar (Datos extendidos, Fig. 10).

El sistema presentó una serie de desafíos de diseño, incluida la incompatibilidad de los puntos de apoyo 3 'en las puertas de ADN con reacciones IVT impulsadas por T7 RNAP (datos extendidos Fig. 1) 45, estructuras secundarias de ARN que interfieren que pueden ralentizar el TMSD (Fig. 2 y datos extendidos Fig. 4) y la variación de la eficiencia de transcripción de T7 de diferentes plantillas de ADN36 (Datos ampliados Fig. 2). Estos desafíos brindaron oportunidades para desarrollar principios de diseño de TMSD basados ​​en ARN que creemos que son generalizables a otros sistemas de ingeniería de ácidos nucleicos (Fig. 5 complementaria).

Una de las principales limitaciones de la plataforma es su costo. Los oligos modificados químicamente con purificación pueden costar ~100 USD o más, aunque se puede usar un solo lote para realizar cientos de reacciones. Además, las puertas de ADN a menudo deben purificarse en gel después de la hibridación para eliminar cualquier hebra de ssDNA no unida, lo que puede llevar mucho tiempo y ser laborioso. Sin embargo, observamos que el costo de los tintes químicos para los sistemas de informes de aptámeros de ARN que activan la fluorescencia no es despreciable, y las ventajas proporcionadas por el sistema TMSD, como la velocidad de respuesta mejorada y la potencia computacional, superan sus limitaciones.

La característica clave de este estudio fue demostrar el potencial de los circuitos TMSD para ampliar la función de los biosensores sin células al actuar como capas de procesamiento de información. Si bien recientemente se desarrolló un enfoque para interconectar la biodetección basada en aTF con TMSD a través de cascadas de TMSD mediadas por endonucleasas54, no se presentó ningún cálculo molecular programable más allá de la simple detección de contaminantes. Como demostración, modelamos, diseñamos y validamos varios circuitos TMSD basados ​​en ARN en capas capaces de realizar cálculos complejos de puertas lógicas con entradas de moléculas pequeñas mediante la adaptación de varios elementos de puertas lógicas TMSD basadas en ADN (Figs. 4 y 5, y Figs. de datos extendidos). 5–7). Aunque no se muestra, se podrían diseñar circuitos lógicos más complejos como XOR y XNOR superponiendo puertas adicionales.

Para resaltar aún más la capacidad de la plataforma para el procesamiento de información, desarrollamos un circuito ADC genético que se puede usar para estimar una concentración de ligando de entrada a un nivel semicuantitativo (Fig. 6). En particular, este circuito utiliza cálculo de umbral para convertir una señal analógica de una concentración de molécula de entrada en una salida digital del número de tubos activados. Este desarrollo fue posible gracias a la capacidad de ajustar con precisión las tasas de reacción de TMSD en función de la longitud del punto de apoyo. Sin embargo, observamos que este circuito ADC genético es diferente de un circuito ADC eléctrico en que su resultado depende del tiempo de activación y no del nivel de activación, porque el circuito se basa en la cinética de reacción de umbral en lugar de concentraciones de entrada estrictas. Como resultado, esta estrategia es más adecuada para distinguir entre las concentraciones de ligandos que causan diferencias en la cinética de salida (Datos extendidos Fig. 8e-g).

Creemos que esta plataforma abre la puerta a otros tipos de computación molecular en sistemas libres de células. Por ejemplo, se podría aplicar un circuito de amplificación como un conjunto de horquilla catalítica55 a ROSALIND con TMSD para amplificar señales y hacer que un sensor sea ultrasensible. Más allá del umbral, otras operaciones demostradas en arquitecturas de compuertas de balancín de ADN podrían trasladarse a esta plataforma para varios cálculos46. Específicamente, las puertas lógicas se pueden extender para desarrollar una estrategia general para corregir la promiscuidad7 del ligando de un TF. Además, debido a que se puede usar prácticamente cualquier aTF que funcione en un contexto in vitro7, se pueden agregar múltiples puertas de ADN con diferentes reporteros para la multiplexación. El papel fundamental que desempeñan los circuitos ADC en la interfaz de circuitos electrónicos analógicos y digitales también promete adoptar diseños de circuitos electrónicos adicionales para las reacciones bioquímicas.

Juntos, estos resultados muestran que establecer una interfaz entre la biodetección de moléculas pequeñas y los circuitos TMSD es un primer paso prometedor hacia la creación de una plataforma de computación molecular general para mejorar y expandir la función de las tecnologías de biodetección sin células.

Se usó la cepa K12 de Escherichia coli (NEB Turbo Competent E. coli, New England Biolabs, nº de catálogo C2984) para la clonación de rutina. Se utilizó la cepa de E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS (Novagen, nº de catálogo 71401) para la expresión de proteína recombinante. Se usó caldo Luria suplementado con los antibióticos apropiados (100 µg ml−1 de carbenicilina, 100 µg ml−1 de kanamicina y/o 34 µg ml−1 de cloranfenicol) como medio de crecimiento.

Las puertas de señal de ADN utilizadas en este estudio fueron sintetizadas por tecnologías de ADN integradas como oligos modificados. Se generaron desnaturalizando un oligonucleótido modificado con 6-carboxifluoresceína (6-FAM) y el oligonucleótido modificado con extintor Iowa Black FQ complementario (Datos complementarios 1) a 95 ° C por separado durante 3 min y enfriamiento lento (-0,1 ° C s-1) a temperatura ambiente en tampón de recocido (acetato de potasio 100 mM y HEPES 30 mM, pH 8,0). Los oligonucleótidos recocidos se purificaron resolviéndolos en geles PAGE-Tris-Borate-EDTA (TBE) nativos al 20 %, aislando la banda del tamaño esperado y eluyendo a 4 °C durante la noche en tampón de recocido. A continuación, la puerta de ADN eluida se precipitó con etanol, se resuspendió en H2O ultrapura MilliQ y se cuantificó la concentración con el espectrofotómetro UV-Vis Thermo Scientific NanoDrop One Microvolume. Las puertas de ADN utilizadas en las Figs. 4–6 y datos extendidos Las figuras 6 y 7 se prepararon usando el mismo método pero recociendo dos oligonucleótidos complementarios sin ninguna modificación.

Los oligonucleótidos de ADN para clonación y secuenciación fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies. Los genes que codifican aTF se sintetizaron como gBlocks (Integrated DNA Technologies) o fragmentos de genes (Twist Bioscience). Los plásmidos de expresión de proteínas se clonaron utilizando Gibson Assembly (NEB Gibson Assembly Master Mix, New England Biolabs, catálogo n.º E2611) en un esqueleto de plásmido pET-28c y se diseñaron para sobreexpresar proteínas recombinantes como fusiones marcadas con His en el extremo C. Una construcción para expresar SmtB incorporó adicionalmente una secuencia de reconocimiento para la escisión y eliminación de la etiqueta His utilizando la proteasa TEV. Las construcciones ensambladas por Gibson se transformaron en células NEB Turbo y las colonias aisladas se purificaron para determinar el ADN del plásmido (kit QIAprep Spin Miniprep, Qiagen, nº de catálogo 27106). Las secuencias de plásmidos se verificaron con la secuenciación de ADN de Sanger (Quintara Biosciences) utilizando los cebadores enumerados en Datos complementarios 1.

Todas las plantillas de transcripción se generaron usando uno de los dos métodos: (1) amplificación por PCR (Phusion High-Fidelity PCR Kit, New England Biolabs, catálogo n.º E0553) de un oligo que incluye un promotor T7, un sitio operador aTF opcional, el la secuencia codificante de InvadeR y un terminador T7 opcional utilizando los conjuntos de cebadores; o (2) hibridación de dos oligonucleótidos complementarios que incluyen un promotor T7, un sitio operador aTF opcional, las secuencias codificantes de la puerta InvadeR o RNA NOT. Todos los conjuntos de oligos y cebadores utilizados en este estudio se enumeran en Datos complementarios 1. Aquí, definimos el promotor T7 como una secuencia mínima de 17 pb (TAATACGACTCACTATA) que excluye la primera G que se transcribe. Las plantillas amplificadas por PCR se purificaron (kit de purificación de PCR QIAquick, Qiagen, n.º de catálogo 28106) y se verificó la presencia de una sola banda de ADN del tamaño esperado en un gel de agarosa con Tris-acetato-EDTA al 2 %. Las plantillas generadas mediante la hibridación de dos oligos complementarios se prepararon y purificaron utilizando el mismo método descrito en "Preparación de puertas de ADN". Las concentraciones de todas las plantillas de ADN se determinaron con el kit de ensayo Qubit dsDNA BR (Invitrogen, n.º de catálogo Q32853).

Todos los plásmidos y moldes de ADN se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Una hoja de cálculo que enumera las secuencias y los números de acceso de Addgene de todos los plásmidos y oligos generados en este estudio se enumeran en Datos complementarios 1.

Las variantes de InvadeR utilizadas para los ensayos de unión de oligopurificados se expresaron primero mediante una IVT nocturna a 37 °C a partir de una plantilla de transcripción que codifica una ribozima de hepatitis D que escinde en cis en el extremo 3′ de la secuencia de InvadeR con los siguientes componentes: tampón IVT ( Tris-HCl 40 mM, pH 8, MgCl2 8 mM, ditiotreitol 10 mM, NaCl 20 mM y espermidina 2 mM), NTP 11,4 mM, pH 7,5, 0,3 unidades (U) de pirofosfatasa inorgánica termoestable (New England Biolabs, n.º de catálogo M0296S) , plantilla de transcripción 100 nM, 50 ng de T7 RNAP y MilliQ H2O ultrapura hasta un volumen total de 500 µl. Las reacciones IVT durante la noche se precipitaron con etanol y se purificaron resolviéndolas en un gel de urea al 20 %-PAGE-TBE, aislando la banda del tamaño esperado (26-29 nucleótidos) y eluyendo a 4 °C durante la noche en H2O ultrapura MilliQ. Las variantes de InvadeR eluidas se precipitaron con etanol, se resuspendieron en agua ultrapura MilliQ, se cuantificaron con el kit de ensayo Qubit RNA BR (Invitrogen, n.º de catálogo Q10211) y se almacenaron a –20 °C hasta su uso. La secuencia de la ribozima de la hepatitis D utilizada se puede encontrar en los Datos complementarios 1.

Los aTF se expresaron y purificaron como se describió anteriormente7. Brevemente, los plásmidos pET-28c de secuencia verificada se transformaron en la cepa de E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS. Los cultivos celulares (1–2 L) se cultivaron en caldo Luria a 37 °C, se indujeron con 0,5 mM de isopropil-β-d-tiogalactósido a una densidad óptica (600 nm) de ~0,5 y se cultivaron durante 4 h más a 37 ºC A continuación, los cultivos se sedimentaron mediante centrifugación y se almacenaron a –80 °C o se resuspendieron en tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 8, NaCl 500 mM, Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 1 mM e inhibidor de la proteasa (Complete Cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA, Roche)) para purificación. A continuación, las células resuspendidas se lisaron en hielo mediante ultrasonidos y los materiales insolubles se eliminaron mediante centrifugación. Luego, el sobrenadante clarificado que contenía TetR se purificó mediante cromatografía de afinidad con etiqueta His con una columna Ni-NTA (columna HisTrap FF de 5 ml, GE Healthcare Life Sciences) seguida de cromatografía de exclusión por tamaño (columna Superdex HiLoad 26/600 de 200 pg, GE Healthcare Life Sciences) utilizando un sistema de cromatografía líquida de proteínas rápida AKTAxpress. Los sobrenadantes clarificados que contenían TtgR y SmtB se purificaron mediante cromatografía de afinidad con etiqueta His con una columna de gravedad cargada con agarosa Ni-NTA (Qiagen, catálogo n.º 30210). Las fracciones eluidas de la cromatografía líquida rápida de proteínas (para TetR) o de la columna de gravedad (para TtgR y SmtB) se concentraron y se intercambiaron tampones (Tris-HCl 25 mM, NaCl 100 mM, TCEP 1 mM, glicerol al 50% v/v). ) usando filtración centrífuga (Amicon Ultra-0.5, Millipore Sigma). Las concentraciones de proteínas se determinaron utilizando el kit de ensayo de proteínas Qubit (Invitrogen, nº de catálogo Q33212). La pureza y el tamaño de las proteínas se validaron en un gel SDS-PAGE (Mini-PROTEAN TGX y Mini-TETRA cell, Bio-Rad). Las proteínas purificadas se almacenaron a –20 °C.

Las reacciones IVT caseras se prepararon agregando los siguientes componentes enumerados en su concentración final: tampón IVT (Tris-HCl 40 mM pH 8, MgCl2 8 mM, ditiotreitol 10 mM, NaCl 20 mM y espermidina 2 mM), NTP 11,4 mM pH 7,5 , 0,3 U de pirofosfatasa inorgánica termoestable (New England Biolabs, n.º de catálogo M0296S), plantilla de transcripción, puertas de ADN y H2O ultrapura MilliQ hasta un volumen total de 20 µl. Las reacciones IVT reguladas incluyeron además un aTF purificado a la concentración indicada y se equilibraron a 37 °C durante ~10 min. Inmediatamente antes de las mediciones del lector de placas, se añadieron a la reacción 2 ng de T7 RNAP y, opcionalmente, un ligando a la concentración indicada. A continuación, las reacciones se caracterizaron en un lector de placas como se describe en 'Cuantificación del lector de placas y estandarización de fluoresceína equivalente micromolar'.

Para los productos de ARN que se muestran en las imágenes de gel de las Figs. de datos extendidos. 1c, fy 2c, las reacciones IVT se establecieron primero como se describe anteriormente. Luego, se realizó una extracción con fenol-cloroformo seguida de una precipitación con etanol para eliminar las proteínas. A continuación, las reacciones se rehidrataron en tampón TURBO DNasa 1x con 2 U de TURBO DNasa (Invitrogen, nº de catálogo QAM2238) hasta un volumen total de 20 µl y se incubaron a 37 °C durante 30 min para eliminar las puertas de ADN y las plantillas de transcripción. . La extracción con fenol-cloroformo seguida de precipitación con etanol se realizó nuevamente para eliminar la ADNasa y se rehidrató en H2O ultrapura MilliQ. Las concentraciones de los productos de ARN extraídos se midieron con el kit de ensayo Qubit RNA HS (Invitrogen, nº de catálogo Q32852) y se almacenaron a –20 °C hasta su posterior análisis, como PAGE. Para el análisis PAGE de estos productos de ARN extraídos, se usaron geles de urea al 20 %–PAGE–TBE y se tomaron imágenes de los geles usando un sistema de imágenes ChemiDoc Touch Gel (software Bio-Rad Image Lab Touch v.1.2.0.12).

Antes de la liofilización, las tapas de los tubos de PCR se perforaron con un alfiler para crear tres orificios. Luego se realizó la liofilización de las reacciones de ROSALIND ensamblando los componentes de IVT (arriba) con la adición de sacarosa 50 mM y d-manitol 250 mM. Los tubos de reacción ensamblados se transfirieron inmediatamente a un bloque de aluminio preenfriado y se colocaron en un congelador a -80 °C durante 10 min para permitir la congelación lenta. Después de la congelación lenta, los tubos de reacción se envolvieron en Kimwipes y papel de aluminio, se sumergieron en nitrógeno líquido y luego se transfirieron a un sistema de liofilización de sobremesa FreeZone de 2,5 l (Labconco) para liofilizar durante la noche con una temperatura del condensador de –85 °C. y 0,04 mbar de presión. A menos que se rehidraten inmediatamente, las reacciones liofilizadas se envasaron como sigue. Las reacciones se colocaron en una bolsa sellable al vacío con un desecante (Dri-Card Desiccants, Uline, catálogo n.º S-19582), se purgaron con argón utilizando un recipiente de argón (ArT Wine Preserver, Amazon, catálogo n.º 8541977939) y se sellado al vacío (Máquina selladora al vacío KOIOS, Amazon, n.º de catálogo TVS-2233). Luego, la bolsa sellada al vacío se colocó en una bolsa protectora de la luz (bolsas para alimentos Mylar con extremos abiertos, Uline, n.º de catálogo S-11661), termosellada (selladora de bolsas Impulse de 8 pulgadas de Metronic, Amazon, n.º de catálogo 8541949845 ) y almacenado en un área fresca y sombreada hasta su uso.

Se usó un estándar rastreable del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (Invitrogen, número de catálogo F36915) para convertir mediciones de fluorescencia arbitrarias en fluoresceína equivalente micromolar (MEF). Se prepararon diluciones en serie de un stock de 50 µM en tampón de borato de sodio 100 mM a pH 9,5, incluido un blanco de tampón de borato de sodio 100 mM (un total de 12 muestras). Para cada concentración, se crearon nueve réplicas de muestras en lotes de tres, y los valores de fluorescencia se leyeron a una longitud de onda de excitación de 495 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm para fluorescencia activada con 6-FAM (fluoresceína), o a una longitud de onda de excitación de 472 nm y longitud de onda de emisión de 507 nm para fluorescencia activada por brócoli dimérico de unión de 3 vías (3WJdB) en un lector de placas (Synergy H1, BioTek Gen5 v.2.04). Se excluyeron del análisis los valores de fluorescencia para una concentración de fluoresceína en la que una única réplica saturaba el lector de placas. Las réplicas restantes (nueve por muestra) luego se promediaron en cada concentración de fluoresceína, y el valor de fluorescencia promedio del blanco se restó de todos los valores. Luego se realizó una regresión lineal para concentraciones dentro del rango lineal de fluorescencia (0–3,125 µM de fluoresceína) entre los valores de fluorescencia medidos en unidades arbitrarias y la concentración de fluoresceína para identificar el factor de conversión. Para cada lector de placas, configuración de excitación, emisión y ganancia, encontramos un factor de conversión lineal que se usó para correlacionar valores de fluorescencia arbitrarios con MEF (Figura 1 complementaria y Datos complementarios 3).

Para la caracterización, se cargaron 19 µl de reacciones en una placa de fondo plano ópticamente transparente de 384 pocillos usando una pipeta multicanal, se cubrió con un sello de placa y se midió en un lector de placas (Synergy H1, BioTek Gen5 v.2.04). El análisis cinético de la fluorescencia activada por 6-FAM (fluoresceína) se realizó leyendo la placa a intervalos de 1 minuto con longitudes de onda de excitación y emisión de 495 y 520 nm, respectivamente, durante 2 horas a 37 °C. El análisis cinético de la fluorescencia activada por 3WJdB se realizó leyendo la placa a intervalos de 3 minutos con longitudes de onda de excitación y emisión de 472 y 507 nm, respectivamente, durante 4 horas a 37 °C. Luego, los valores de fluorescencia arbitrarios se convirtieron a MEF dividiendo con el factor de conversión de calibración apropiado.

Excepto por los datos en la Fig. 6b, no se realizó ninguna sustracción de fondo al analizar los resultados de cualquier reacción. En la figura complementaria 1 se muestra un ejemplo de este procedimiento de estandarización.

Los datos que se muestran en la Fig. 6b se generaron como se indicó anteriormente y luego se normalizaron utilizando el siguiente método para comparar las observaciones experimentales con las simulaciones ODE. Los valores de fluorescencia sin procesar se estandarizaron primero a MEF (fluoresceína µM) utilizando el método descrito anteriormente. Luego se determinó el valor máximo de MEF entre todas las reacciones (5 condiciones × 3 réplicas = 15 reacciones). Luego, cada valor de MEF en cada intervalo de tiempo se normalizó utilizando la siguiente fórmula:

Se realizó una sustracción de fondo para tener en cuenta la fluorescencia distinta de cero observada para la puerta de señal de ADN extinguida. Una vez que todos los datos se normalizaron de acuerdo con la fórmula anterior, se promediaron n = 3 repeticiones por condición y se calculó el valor de desviación estándar correspondiente por condición.

Imágenes de gel sin procesar y sin recortar presentadas en la figura complementaria 2d y las figuras de datos extendidos. 1c, f y 2c están disponibles como datos de origen o como datos complementarios 2 y están depositados en Mendeley Data (https://doi.org/10.17632/hr3j3yztxb.1). La intensidad de la banda de un gel de urea-PAGE teñido con oro SYBR en Extended Data Fig. 2c se calculó con Fiji-ImageJ utilizando el método tradicional de perfil de carril como se describió anteriormente56. Brevemente, se registró una región de interés en cada carril utilizando un rectángulo de las mismas dimensiones. Luego, se tuvo en cuenta el fondo irregular dibujando una línea recta en la parte inferior de cada pico, y se calculó el área del pico en cada carril usando la herramienta de varita. Luego, las áreas de los picos del estándar de ARN se trazaron frente a las cantidades totales cargadas para crear la curva estándar en Datos extendidos Fig. 2d (rango lineal: 0,25–2 ng). Utilizando el factor de conversión de la curva estándar, las concentraciones de las variantes de InvadeR se estimaron a partir de los valores de área de pico obtenidos con la herramienta de varita.

Para el agua del grifo enriquecida con ZnSO4 de Evanston, IL, se recogieron de un bebedero dos botellas que contenían aproximadamente 50 ml de las muestras de agua. A continuación, una de las botellas se filtró a 0,22 µm utilizando un sistema de filtración al vacío estéril Steriflip-GP (Millipore Sigma, nº de catálogo SCGP00525). Tanto las muestras de agua filtrada como las no filtradas se enriquecieron con una solución de ZnSO4 10, 1 o 0,1 mM que se había diluido a partir de la solución madre de ZnSO4 2 M (Sigma, n.º de catálogo 83265). Después de la rehidratación, se realizaron mediciones de fluorescencia de las reacciones utilizando un lector de placas (consulte 'Cuantificación del lector de placas y estandarización de MEF'). Para el agua del lago Michigan enriquecida con ZnSO4 de Evanston, IL, se aplicó el mismo método de muestreo.

Las ODE para cada especie de reactivo se derivaron utilizando la cinética de reacción de unión a TF, IVT y TMSD. Las ODE se calcularon utilizando una función de resolución de ODE, odeint del paquete Scipy.Integrate en Python v.3.7.6. Los parámetros cinéticos se estimaron a partir de la literatura, y las condiciones iniciales se establecieron en condiciones experimentales, con especies intermedias establecidas en cero. Los detalles de las simulaciones ODE se analizan en Información complementaria.

El número de réplicas y los tipos de réplicas realizadas se describen en la leyenda de cada figura. Se muestran puntos de datos individuales y, cuando corresponda, se muestra el promedio ± sd; esta información se proporciona en la leyenda de cada figura. El tipo de análisis estadístico realizado en la Fig. 3d y la Fig. 3 de datos extendidos se describe en la leyenda de cada figura. Los valores P exactos junto con los grados de libertad calculados a partir del análisis estadístico se pueden encontrar en los datos de origen.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos presentados en este documento están disponibles como datos de origen y como datos complementarios. Todos los datos de origen, así como los Datos Suplementarios 2 y 3, también están depositados en Mendeley Data (doi: 10.17632/hr3j3yztxb.1)57. Todos los plásmidos utilizados en este documento están disponibles en Addgene con los identificadores 140371, 140374, 140391 y 140395. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los archivos de Jupyter Notebook con los códigos de Python utilizados en la figura 5 de datos ampliados, la figura 8 de datos ampliados y la figura 6 se proporcionan como datos complementarios 6, y el modelo ODE utilizado en este documento se describe en la información complementaria. Los códigos de Python también están disponibles en GitHub en https://git.io/Jtlh1 (ref. 58).

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Jung, JK, Archuleta, CM, Alam, KK Lucks, JB Programación de biosensores libres de células con circuitos de desplazamiento de cadenas de ADN. GitHub https://git.io/Jtlh1 (2021).

Descargar referencias

Agradecemos a A. Thompson (Northwestern University) y C. Knopp (Northwestern University) por administrar los reactivos experimentales y el equipo utilizado en este estudio; J. Hester (Northwestern University), A. Curtiss (Northwestern University) y J. Mamish (Northwestern University) por su útil discusión sobre la arquitectura del circuito ADC; S. Schaffter (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología) por la edición del manuscrito y la útil discusión sobre los circuitos TMSD; J. Peruzzi (Northwestern University) por su ayuda con las mediciones de NanoDrop; S. Pshenychnyi (Núcleo de Producción de Proteínas Recombinantes en la Universidad Northwestern) por su asistencia en la purificación de proteínas. JKJ fue apoyado en parte por el Grupo de la Escuela de Graduados en Biotecnología, Sistemas y Biología Sintética de la Universidad Northwestern, que está afiliado al Programa de Capacitación en Biotecnología, por una Beca Ryan y por una Beca de Fin de Año de la Escuela de Ingeniería McCormick. CMA recibió el apoyo del Departamento de Defensa a través del programa de becas para graduados en ingeniería y ciencia de la defensa nacional (NDSEG). Este trabajo también fue apoyado por fondos de NSF CAREER (1452441 para JBL), NSF MCB RAPID (1929912 para JBL), apoyo del Crown Family Center for Jewish and Israel Studies en Northwestern University (para JBL) y Searle Funds en The Chicago Community Confianza (a JBL).

Departamento de Ingeniería Química y Biológica, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Jaeyoung K. Jung, Chloé M. Archuleta y Julius B. Lucks

Centro de Biología Sintética, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Jaeyoung K. Jung, Chloé M. Archuleta y Julius B. Lucks

Centro de Investigación del Agua, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Jaeyoung K. Jung, Chloé M. Archuleta y Julius B. Lucks

Stemloop, Inc., Evanston, IL, EE. UU.

Khalid K. Alam y Julius B. Suerte

Programa de Posgrado en Ciencias Biológicas Interdisciplinarias, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Julius B. Suerte

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JKJ, KKA y JBL diseñaron el estudio. JKJ, CMA y JBL analizaron los datos. JKJ, CMA y KKA realizaron la investigación. JKJ, KKA y JBL desarrollaron la metodología. JKJ y JBL emprendieron la visualización de los datos. JKJ y CMA desarrollaron el software. JKJ, KKA, CMA y JBL escribieron el artículo. JKJ y JBL seleccionaron los datos. JBL obtuvo fondos para el estudio. JKJ y CMA validaron los resultados. JKJ y JBL gestionaron y coordinaron el estudio. JKJ y JBL supervisaron la investigación.

Correspondencia a Julius B. Lucks.

KKA, JKJ y JBL han presentado una solicitud de patente internacional que ha sido nacionalizada en los EE. UU. (No. US 17/309,240) y en Europa (No. EP19881824.7) relacionada con reacciones de transcripción in vitro reguladas, una solicitud de patente internacional (PCT /US2020/030112, No. 62/838,852) relacionado con la preservación y estabilización de reacciones de transcripción in vitro, y una solicitud provisional de EE. UU. (PCT/US2020/030112 o US provisional No. 63/154,247) relacionada con biosensores Circuitos de desplazamiento de cadenas de ADN. KKA y JBL son fundadores y tienen intereses financieros en Stemloop, Inc. Estos últimos intereses son revisados ​​y administrados por Northwestern University de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. CMA declara que no hay intereses en competencia.

Nature Chemical Biology agradece a Jerome Bonnet y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, en presencia de componentes IVT, T7 RNAP puede unirse de manera no específica a la región de apoyo de la puerta de señal de ADN. Cuando el punto de apoyo está en el extremo 3' de la puerta, esto conduce a la transcripción de productos secundarios de ARN no deseados que pueden desplazar la hebra extintora. Este proceso se bloquea cuando el punto de apoyo está en el extremo de 5' de la puerta. b, la puerta de señal de ADN de 3' toehold conduce a la activación de fluorescencia en presencia de T7 RNAP, mientras que la puerta de señal de ADN de 5' toehold no lo hace. c, cuando los productos de reacción de b se extrajeron y se procesaron en un gel de urea-poliacrilamida, los productos secundarios de ARN aparecen solo en la puerta de señal de ADN de 3' toehold. Un control negativo en el que no está presente una puerta de señal de ADN en la reacción (-) se corrió al mismo tiempo para puntos de apoyo de 3' y 5'. d, la modificación de la puerta de ADN con oligonucleótidos 2'-O-metil evita la transcripción independiente del promotor por T7 RNAP. e, cuando la puerta de señal de ADN del toehold 3' se modifica con oligonucleótidos 2'-O-metil, no se observa activación de fluorescencia en ausencia de una plantilla IVT dirigida por T7 RNAP. f, cuando las reacciones de e se realizaron en un gel de urea-poliacrilamida, no se observaron productos secundarios de ARN de la puerta de señal de ADN 2'-O-metilo. Un control negativo en el que no hay puerta de señal de ADN presente en la reacción (-) se ejecutó junto con las puertas no modificadas y modificadas. Los datos que se muestran en b y e son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como una línea con fluorescencia sin procesar estandarizada para MEF (fluoresceína µM). El sombreado indica el promedio de las réplicas ± desviación estándar. Los datos que se muestran en c y f son representativos de n = 3 réplicas biológicas independientes. La imagen de gel sin recortar y sin procesar que se muestra en c y f está disponible como datos de origen.

Datos fuente

a, Los ocho nucleótidos transcritos inicialmente de cada variante de InvadeR en la Fig. 2a. Los nucleótidos que no forman parte de las secuencias de InvadeR están en negrita y los nucleótidos insertados están subrayados. b, Concentraciones de cada variante de las reacciones IVT medidas con el kit de ensayo Qubit RNA HS (Invitrogen, n.º de catálogo Q32852). Cada variante se produjo in situ en presencia de la puerta de señal de ADN durante 30 minutos y se extrajo (consulte la sección de extracción de ARN de reacciones IVT en Materiales y Métodos). La concentración de la variante 1 era demasiado baja para la cuantificación de Qubit. c, Las muestras medidas en b se corrieron en un gel de urea-poliacrilamida y se tiñeron con oro SYBR. Se realizó la titulación de un estándar de ARN de una longitud similar para determinar el rango lineal del área del pico de la banda cuantificada por Fiji–ImageJ56. d, Se construyó una curva de calibración trazando el área del pico calculada a partir de la cuantificación de Fiji-ImageJ frente a la cantidad total de estándar cargado. e, Usando la curva de calibración en d, se determinó la cantidad total de ARN para cada variante y se comparó con las mediciones realizadas por Qubit en b. Los datos en b se muestran para n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como un punto con la altura de la barra que representa el promedio. Las barras de error indican el promedio de las réplicas ± desviación estándar. Los datos que se muestran en c son representativos de n = 3 réplicas biológicas independientes. La imagen de gel sin recortar y sin procesar que se muestra en c está disponible como datos de origen.

Datos fuente

Las plantillas de ADN que codifican InvadeR se modifican para contener el promotor T7 seguido de un espaciador de 2 pb y una secuencia de operador aTF cadena arriba de la secuencia de InvadeR. Las estructuras secundarias, las energías libres mínimas y las probabilidades de emparejamiento de bases de a, GG–tetO–InvadeR, b, GG–ttgO–InvadeR y c, GA–smtO–Hairpin2–InvadeR (variante espaciadora 1BP) se predicen utilizando NUPACK a 37 °C30. La secuencia GA–smtO–Hairpin2–InvadeR incluye una horquilla diseñada para minimizar la interferencia estructural de InvadeR por smtO (Datos extendidos Fig. 4h, i). La secuencia complementaria a la puerta de señal se indica con una línea punteada y se resalta en sombreado verde. d, TetR se usa para detectar tetraciclina. e, TtgR, un ATF de la familia MarR, se utiliza para detectar la naringenina. f, SmtB se usa para detectar zinc. Las variaciones en la cinética de activación coinciden con la tendencia en la que la estructura secundaria predicha de InvadeR afecta la velocidad de inducción. Para evaluar el límite de detección de cada sensor, se creó una curva de respuesta a la dosis para g, tetraciclina, h, naringenina e i, ZnSO4 (datos de punto final de 1 h). Todos los datos que se muestran son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como una línea (d–f) o un punto (g–i) con valores de fluorescencia sin procesar estandarizados para MEF (μM de fluoresceína). El sombreado (d–f) y las barras de error (g–i) indican el promedio de las réplicas ± la desviación estándar. Las concentraciones de ligando a las que las señales se distinguen del fondo se determinaron utilizando una prueba t de Student heteroscedástica de dos colas contra la condición sin ligando, y sus rangos de valores de P se indican con asteriscos (***P < 0,001, * *P = 0,001–0,01, *P = 0,01–0,05). Los valores P exactos junto con los grados de libertad se pueden encontrar en Datos de origen. Los datos para la condición sin ligando se excluyeron porque el eje x está en la escala logarítmica y se presentan en Datos de origen.

Datos fuente

a, Estructura secundaria, energía libre mínima y probabilidades de emparejamiento de bases de GA-smtO–InvadeR predichas por NUPACK a 37 °C30. Una parte de la secuencia smtO de tipo salvaje forma un fuerte bucle de tallo predicho con InvadeR. Los nucleótidos resaltados en verde corresponden a la secuencia de InvadeR que desplaza la hebra de la puerta de señal de ADN. b, Estructura secundaria, energía libre mínima y probabilidades de emparejamiento de bases de GA-smtO–InvadeR–InvadeR predichas por NUPACK a 37 °C30. c, Comparación de la cinética de la reacción GA-smtO–InvadeR no regulada y la reacción GA-smtO–InvadeR–InvadeR no regulada. d, e, estructuras secundarias predichas por NUPACK, energías libres mínimas y probabilidades de emparejamiento de bases de las dos variantes GA-smtO-Hairpin-InvadeR diseñadas para secuestrar la secuencia smtO y evitar que se una a InvadeR. Los nucleótidos resaltados en gris indican la secuencia secuestrante añadida. f, Comparación de la cinética de las reacciones no reguladas de las variantes mostradas en d y e. g, Las variantes GA-smtO–Hairpin2–InvadeR se construyeron alargando la longitud del tallo o el espaciador entre la horquilla y la secuencia InvadeR. Las variantes de longitud de vástago se construyen con el espaciador de 0 nt y las variantes de espaciador se construyen con la longitud de vástago de 12 pb. h, i, Comparación de la cinética de las reacciones no reguladas de las variantes GA-smtO–Hairpin2–InvadeR. Todos los datos que se muestran son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como una línea con valores de fluorescencia sin procesar estandarizados para MEF (fluoresceína μM). Los sombreados indican el promedio de las réplicas ± desviación estándar.

Datos fuente

Las simulaciones de puertas lógicas discutidas en las Figs. 4, 5 y datos extendidos Fig. 7 se muestran junto con las tendencias de trayectoria simuladas esperadas. Todos los códigos de cuadernos de Jupyter utilizados para simular los resultados están disponibles como Datos complementarios 6, y el método utilizado para desarrollar el modelo ODE para cada puerta lógica representativa se analiza en la Información complementaria.

Datos fuente

a, La secuencia y el diseño de la puerta AND de ADN que se muestra en la Fig. 4c. Los desajustes actúan como el controlador termodinámico para hacer avanzar la reacción. El dominio de abrazadera evita que el hilo superior se desplace solo con la Entrada 1 (naranja). b, Sin controladores termodinámicos, no se observa señal. El alargamiento de la abrazadera reduce la fuga por Entrada 1. La fuga observada desde la abrazadera ac, 3-bp, d, 5-bp y e, 7-bp. f, Las secuencias y diseños de las puertas InvadeR y RNA NOT sin ninguna secuencia de operador. La falta de coincidencia entre InvadeR y la puerta de señal se resalta en rojo. La variante 2 incorpora 6 adeninas adicionales que fortalecen sus interacciones con la puerta NOT. La puerta 1 de NOT tiene un punto de apoyo de 4 nt mientras que las puertas 2 y 3 de NOT tienen puntos de apoyo de 6 nt. La puerta 3 de NOT tiene una adenina adicional después de las guaninas de inicio que aumenta su eficiencia de transcripción36. Titulación de la plantilla que codifica la puerta NOT 1 en presencia de 25 nM de la plantilla que codifica InvadeR g, variante 1 y h, variante 2. Mientras que la variante 2 requiere más plantilla de puerta NOT para bloquear la señal, se observa una señal más fuerte en la variante 2 sin la puerta NOT. Titulación de la plantilla que codifica NO la puerta i, 2 y j, 3 en presencia de 25 nM de la plantilla de la variante 2 de InvadeR. Las puertas NOT 2 y 3 son más eficientes para secuestrar a InvadeR que la puerta NOT 1. k, la incorporación de la secuencia del operador en la puerta NOT afecta su estructura. NUPACK predice que la secuencia smtO (gris claro) interactúa con una parte de la puerta NOT 3, bloqueando el toehold30. Una secuencia espaciadora (subrayada) puede restaurar la estructura esperada de la puerta NOT. Titulación de la plantilla que codifica l, smtO–NOT gate 3 yk, smtO–spacer–NOT gate 3 en presencia de 25 nM de la plantilla InvadeR variante 2. Todas las reacciones mostradas no están reguladas. Todos los datos que se muestran son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como una línea con fluorescencia sin procesar estandarizada para MEF (fluoresceína µM). El sombreado indica el promedio de las réplicas ± desviación estándar.

Datos fuente

a, puerta NOT inducida por tetraciclina que se muestra en la Fig. 4e. b, Se usó una plantilla que codifica la secuencia mezclada de la puerta NOT regulada por TetR como control para demostrar que la reducción de la señal inducida por tetraciclina no se debe a limitaciones de recursos. c, la puerta NOT inducida por ZnSO4 se puede diseñar de la misma manera. La secuencia espaciadora se agregó para evitar que la secuencia smtO interrumpa la estructura de la puerta NOT (Datos extendidos, Fig. 6). d, En presencia de ZnSO4, la señal de fluorescencia se desactiva. De manera similar, se muestran las reacciones de control con una plantilla que codifica la secuencia mezclada de la puerta NOT regulada por SmtB. e, Una puerta tet IMPLY ZnSO4 diseñada como se describe en la Fig. 5c. f, se observa activación de fluorescencia a menos que solo se agregue tetraciclina. g, una puerta tet IMPLY ZnSO4 se puede construir alternativamente al incluir una plantilla inducible por ZnSO4 que interactúa con la puerta de señal en lugar de la puerta OR. h, la puerta IMPLY alternativa realiza el cálculo lógico esperado. Se observa una generación de señal más rápida a partir de las condiciones inducidas por ZnSO4, ya que las hebras de ARN inducidas por ZnSO4 realizan directamente TMSD en la puerta de señal. i, el enfoque alternativo para construir la puerta IMPLY se puede aplicar a la puerta tet IMPLY de ZnSO4, y j, la puerta realiza el cálculo lógico esperado. k, Una puerta tet NIMPLY ZnSO4 está diseñada de la misma manera que la puerta tet ZnSO4 NIMPLY que se muestra en la Fig. 5g. l, la puerta tet NIMPLY ZnSO4 realiza el cálculo lógico esperado. Todas las condiciones experimentales utilizadas en esta figura se pueden encontrar en Datos complementarios 5. Todos los datos que se muestran son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como una línea con fluorescencia sin procesar estandarizada para MEF (fluoresceína µM). El sombreado indica el promedio de las réplicas ± desviación estándar.

Datos fuente

Las trazas cinéticas correspondientes a los datos que se muestran en la Fig. 6e se presentan para la puerta de umbral de 8 nt en diferentes proporciones por encima de una concentración de puerta de señal fija (a, 0X, b, 1X, c, 2X y d, umbral de 3X). El punto de tiempo (t = 100 min) en el que se creó el mapa de calor se indica con una línea de puntos vertical. Las diferencias en la velocidad de respuesta para diferentes concentraciones de zinc son esenciales para crear el estándar. e, Las condiciones de zinc 10 μM y 30 μM no muestran diferencias cinéticas sin ninguna puerta de umbral. f, g, La caracterización funcional y las predicciones de ODE del circuito ADC a los 100 min de la Fig. 6e, d, respectivamente, incluidas las condiciones de umbral de zinc 30 μM y 4X. Las condiciones de zinc 10 μM y 30 μM se comportan de manera idéntica a lo predicho por el modelo ODE debido a su comportamiento cinético idéntico observado en e. h, Los datos del gráfico de barras correspondientes del estándar semicuantitativo que se muestra en f. Todos los datos que se muestran son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como una línea (a–e) o un punto (h) con valores de fluorescencia sin procesar estandarizados para MEF (fluoresceína μM). Las barras en h y los valores en el mapa de calor en f representan promedios de las réplicas. Los sombreados en a–e y las barras de error en h indican el promedio de las réplicas ± desviación estándar.

Datos fuente

Las reacciones no reguladas se liofilizaron durante la noche con la adición de sacarosa 50 mM y D-manitol 250 mM como lioprotectores a menos que se indique lo contrario. Luego, las reacciones liofilizadas se envasaron al vacío en una bolsa protectora liviana con una tarjeta dri-card y se mantuvieron en un área fresca y sombreada hasta su uso (consulte Materiales y métodos para conocer el protocolo detallado). Se muestran las trazas cinéticas de las reacciones rehidratadas después de a, 1 día, b, 4 días y c, 7 días de almacenamiento. Hay una disminución en la señal general, así como en la velocidad de respuesta con el tiempo. Para investigar la causa de la pérdida de señal a lo largo del tiempo, la puerta de señal de ADN sola se liofilizó durante la noche con o sin lioprotectores, se envasó y almacenó como se describe anteriormente. La puerta de señal de ADN se rehidrató con el resto de los componentes IVT después de d, 1 día, e, 4 días y f, 7 días. La velocidad de respuesta y la magnitud de la señal se mantienen, lo que indica que la pérdida de la señal probablemente se deba a la inestabilidad de ciertos componentes IVT. Para probar esta hipótesis, las reacciones no reguladas con NTP tamponadas con Tris, en lugar de NTP tamponadas con NaOH, se liofilizaron con los lioprotectores, se empaquetaron y almacenaron como se describe anteriormente. Se muestran las trazas cinéticas de las reacciones de rehidratación después de g, 1 día, h, 4 días e i, 7 días de almacenamiento. La pérdida de señal se mitiga un poco con NTP tamponados con Tris, pero se observa un grado similar de pérdida de señal para un almacenamiento a largo plazo de reacciones liofilizadas. Todos los datos que se muestran son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como una línea con valores de fluorescencia sin procesar estandarizados para MEF (fluoresceína μM). Los sombreados indican el promedio de las réplicas ± desviación estándar.

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ROSALIND con detección de zinc con reacciones TMSD que usan smtO–InvadeR–InvadeR que se muestran en Datos extendidos Fig. 4b fueron liofilizados y rehidratados con a, agua del grifo y b, agua del lago Michigan enriquecida con un rango de concentraciones de ZnSO4. A continuación, las reacciones se incubaron a 37 °C durante 1 hora y se caracterizaron por fluorescencia. Para cada tipo de muestra de agua, la señal se comparó con la de las reacciones rehidratadas con agua de laboratorio enriquecida con la misma cantidad de ZnSO4. En cada caso, las reacciones se comportaron como se esperaba y no observaron diferencias en la señal entre las muestras de agua filtrada y sin filtrar. Sin embargo, se observa una ligera reducción de la señal de las muestras de agua del mundo real en comparación con las rehidratadas con agua de laboratorio enriquecida con ZnSO4, probablemente debido a los efectos de la matriz. Todos los datos que se muestran son n = 3 réplicas biológicas independientes, cada una representada como un punto con valores de fluorescencia sin procesar estandarizados para MEF (fluoresceína μM). Cada altura de barra representa el promedio de las réplicas y las barras de error indican el promedio de las réplicas ± la desviación estándar.

Datos fuente

Figs suplementarias. 1–5 y Método sobre el modelo ODE utilizado en este estudio.

Secuencias de ADN y proteínas utilizadas en este estudio.

Imagen de gel de urea-PAGE sin procesar que se muestra en la Fig. 2d complementaria.

Datos del lector de placas calibrado para figuras complementarias.

Diseños y secuencias de todas las puertas lógicas construidas en este estudio y sus fuentes.

Condiciones experimentales (ligandos, aTF, plantillas de ADN y concentraciones de puertas de ADN) utilizadas para todas las puertas lógicas y sus parámetros cinéticos utilizados para las simulaciones ODE.

Códigos de cuadernos de Jupyter utilizados para simular los resultados que se muestran en los datos extendidos 5, los datos extendidos 8 y la figura 6.

Datos de origen del lector de placas calibrado para la Fig. 2.

Datos de origen del lector de placas calibrado para la Fig. 3.

Datos de origen del lector de placas calibrado para la Fig. 4.

Datos de origen del lector de placas calibrado para la Fig. 5.

Datos de origen del lector de placas calibrado para la Fig. 6.

Datos de origen del lector de placas calibrado para datos extendidos Fig. 1.

Geles de urea-PAGE sin procesar y sin cosechar que se muestran en la Fig. 1 de datos ampliados y sus breves descripciones.

Datos de origen del lector de placas calibrado para datos extendidos Fig. 2.

Gel de urea-PAGE sin procesar ni cosechar que se muestra en la Fig. 2 de datos ampliados y su breve descripción.

Datos de origen del lector de placas calibrado para datos extendidos Fig. 3.

Datos de origen del lector de placas calibrado para datos extendidos Fig. 4.

Datos de origen del lector de placas calibrado para datos extendidos Fig. 5.

Datos de origen del lector de placas calibrado para datos extendidos Fig. 6.

Datos de origen del lector de placas calibrado para datos extendidos Fig. 7.

Datos de origen del lector de placas calibrado para datos extendidos Fig. 8.

Datos de origen del lector de placas calibrado para datos extendidos Fig. 9.

Datos de origen del lector de placas calibrado para datos extendidos Fig. 10.

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Reimpresiones y permisos

Jung, JK, Archuleta, CM, Alam, KK et al. Programación de biosensores libres de células con circuitos de desplazamiento de hebras de ADN. Nat Chem Biol 18, 385–393 (2022). https://doi.org/10.1038/s41589-021-00962-9

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Recibido: 29 enero 2021

Aceptado: 16 de diciembre de 2021

Publicado: 17 febrero 2022

Fecha de emisión: abril de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41589-021-00962-9

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Biología química de la naturaleza (2022)